标题酶的生产与分离纯化

酶的生产与分离纯化

 主要内容：

            2.1 国内外酶制剂工业生产及应用现状

            2.2 酶的发酵技术

            2.3 酶的分离纯化

            2.4 酶分离、纯化的评价

            2.5 酶的剂型与保存

2.1国内外酶制剂工业生产及应用现状

2.1.1 ．新技术在生产中的应用：

w  三种方法：

n  组织提取：木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶

n  微生物发酵：最大量的来源

n  化学及生物合成：生物重组

w  高新技术的应用：酶的修饰、固定化、基因重组、膜分离技术、冷冻干燥、微胶囊

2.1.3.  品种、规模不断扩大

w 目前30多家600多个品种，应用于18个工业领域。

w 我国2000年酶制剂产量为30万吨，100家，市场份额仅占5%，以未经除菌去渣的粗制品粉状酶为主。

w 国际以液体、颗粒为主。

w 国内糖化酶、ａ-淀粉酶、蛋白酶三大类占了97%，显然不合理。

w 重要产品普鲁兰酶、真菌淀粉酶、系列果胶酶、低温碱性蛋白酶，国内尚未投入生产;

w 我国有7家上市公司介入酶制剂开发生产。

2.1.4.  应用领域不断扩大：

w 美国酶制剂年产值6.25亿美元，食品工业占62%，拓展饲料工业、洗涤剂工业、化学工业。

2.2  酶的发酵技术

w 利用微生物产酶的优点是：

n （1） 微生物种类多、酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样。

n （2） 微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶。

n （3） 微生物培养基来源广泛、价格便宜。

n （4） 可以采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程，生产可连续化、自动化，经济效益高。

n （5） 可以利用以基因工程为主的现代分子生物学技术，选育菌种、增加酶产率和开发新酶种。因此，下面将主要介绍微生物发酵法产酶的一般原理和工艺。

2.2.1  产酶微生物

w 菌种是发酵生产酶的重要条件。菌种不仅与产酶种类、产量密切相关，而且与发酵条件、工艺等关系密切。已经在自然界中发现的酶有数千种，目前投入工业发酵生产的酶约有50～60种。它们的生产菌种十分广泛，包括细菌、放线菌、酵母菌、霉菌。

2.2.2  酶的发酵技术

w 2.2.2.1 培养基

n  培养基的营养成分是微生物发酵产酶的原料，主要是碳源、氮源，其次是无机盐、生长因子和产酶促进剂等。

（1）碳源

w  碳素是构成菌体成分的主要元素，也是细胞贮藏物质和生产各种代谢产物的骨架，还是菌体生命活动的能量的主要来源。当前酶制剂生产上使用的菌种大都是只能利用有机碳 的异养型微生物。有机碳的主要来源有：一是农副产品中如甘薯、麸皮、玉米、米糠等淀粉质原料；二是野生的如土茯苓、橡子、石蒜等淀粉质原料。此外，以石油产品中12 ～16 碳的成分来作碳源，如以某些嗜石油微生物生产蛋白酶、脂酶，均已获得成功。

n  不同的细胞对各种碳源的利用差异很大，所以在配制培养基时应根据不同细胞的不同要求而选择合适的碳源。另外，选择碳源除考虑营养要求外，还要考虑酶生物合成的诱导作用和是否存在分解代谢物阻遏作用。尽量选用具有诱导作用的碳源，尽量不用或少用有分解代谢物阻遏作用的碳源。

n 例如，α－淀粉酶的发酵生产中，应该选用有诱导作用的淀粉作为碳源，而不用对该酶有分解代谢物阻遏作用的果糖作为碳源。

w （2）氮源

n  氮是生物体内各种含氮物质，如氨基酸、蛋白质、核苷酸、核酸等的组成成分。酶制剂生产中的氮源主要有有机氮源和无机氮 源两种，常用的有机氮源有：豆饼、花生饼、菜籽饼、鱼粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、多肽、氨基酸等；无机氮源有：（NH4）2SO4 、NH4Cl 、NH4NO3 、（NH4）3P04 、尿素等。

n  不同的细胞对各种氮源的要求各不相同，应根据要求进行选择和配制。一般来说，动物细胞要求有机氮，植物细胞主要要求无机氮。多数情况下将有机氮源和无机氮源配合使用才能取得较好的效果。例如黑曲霉酸性蛋白酶生产，只用铵盐或硝酸盐为氮源时，酶产量仅为有胨时的30% 。只用有机氮源而不用无机氮源时产量也低，故一般除使用高浓度有机氮源外尚需添加1%~3% 的无机氮源。

w （3） 碳氮比

n  在微生物酶生产培养基中碳源与氮源的比例是随生产的酶类、生产菌株的性质和培养阶段的不同而改变的。

n  一般蛋白酶 （ 包括酸性、中性和碱性蛋白酶）  生产采用碳氮比低的培养基比较有利，例如黑曲霉3.350 酸性蛋白酶生产采用由豆饼粉3.75 % 、玉米粉0.625% 、鱼粉0.625% 。NH4Cl 1% 、CaCl2 0.5% 、Na2HP04 0.2% 、豆饼石灰水解液10% 组成的培养基；  

n  淀粉酶（ 包括α －淀粉酶、糖化酶、β －淀粉酶等） 生产的碳氮比一般比蛋白酶生产略高，例如枯草杆菌TUD127α －淀粉酶生产采用由豆饼粉4 % 、玉米粉8 % 、Na2HP04 0.8% 、 （NH4）2SO4 0.4% 、CaCl2 0.2% 组成的培养基。而在淀粉酶生产中糖化酶生产培养基的碳氮比是最高的。以上是蛋白酶和淀粉酶生产培养基碳氮比的一般规律，但是由于菌种很多而其性质各异。很难说都是符合上述规律的。

n  在微生物酶生产过程中，培养基的碳氮比也因培养过程不同而异。例如种子培养时，为了适应菌体生长繁殖的需要，要求提供合成细胞蛋白质的氮多些，容易利用的氮源的比例大些，种子培养基的碳氮比一般要比发酵培养基低些。发酵时，不同发酵阶段要求的碳氮比也是不同的。例如在枯草杆菌BF －7658 生产α －淀粉酶的发酵过程中，发酵前期要求培养基的碳氮比适当降低，以利菌体生长繁殖，发酵中后期要求培养基的碳氮比适当提高，以促进淀粉酶的生成。

w （4） 无机盐

n 微生物酶生产和其他微生物产品生产一样，培养基中需要有磷酸盐及硫、钾、钠、钙、镁等元素存在。在酶生产中常以磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等磷酸盐作为磷源，以硫酸镁为硫源和镁源。钙离子对淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多种酶的活性有十分重要的稳定作用，例如在无Ca2+存在时灰色链霉菌中性蛋白酶只在pH7~7.5很小范围内稳定，当有Ca2+存在时稳定pH范围可以扩大到5～7。钠离子有控制细胞渗透压使酶产量增加的作用，酶生产的培养基中有时以磷酸氢二钠及硝酸钠等形式加入，例如米曲霉α－淀粉酶生产，添加适量的硝酸钠以促进酶生产。

n 在天然培养基中，一般微量元素不必另外加入，但也有一些例外。如玉米粉、豆粉为碳源时，添加100 ppm Co2+和Zn2+，放线菌166蛋白酶活力可增加70%～80%。