标题植物α-防御素(α-DF)ELISA试剂盒说明书

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本试剂盒仅供体外研究使用、不用于临床诊断!
预期应用
ELISA法定量测定植物植物组织、细胞或其它相关样本中α-防御素（α-DF）含量。

实验原理
用纯化的α-DF抗体包被微孔板，制成固相载体，往微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的α-DF抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物（TMB）显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的α-DF呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（ 值），计算样品浓度。

试剂盒组成及试剂配制
1、 酶标板：一块（96孔）
2、 标准品（冻干品）： 2瓶，请临用前15分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至1ml，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为100 nmol/ml，然后做系列倍比稀释（注：不要直接在板中进行倍比稀释），分别配制成100 nmol/ml，50 nmol/ml，25 nmol/ml，12.5 nmol/ml，6.25 nmol/ml，3.12 nmol/ml，1.56 nmol/ml，样品稀释液直接作为空白孔 0 nmol/ml。如配制50 nmol/ml标准品：取0.5ml （不要少于0.5ml ）100 nmol/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
3、 样品稀释液：1×20ml。
4、 检测稀释液A：1×10ml。
5、 检测稀释液B：1×10ml。
6、 检测溶液A：1×120  /瓶（1:100）。临用前以检测稀释液A 1:100稀释（如：10  检测溶液A / 990 检测稀释液A），充分混匀，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（100 /孔），实际配制时应多配制  0.1-0.2ml。
7、 检测溶液B：1×120  /瓶（1:100）。临用前以检测稀释液B 1:100稀释。稀释方法同检测溶液A。
8、 底物溶液：1×10ml/瓶。
9、 浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
10、终止液：1×10ml/瓶（2 mol/L H2SO4）。
11、覆膜：5张
12、使用说明书：1份

自备物品
1、 酶标仪（建议仪器使用前提前预热）
2、 微量加液器及吸头，EP管
3、 蒸馏水或去离子水，滤纸

植物标本的采集及保存
1、 新鲜植物组织请在液氮中充分研磨；
2、 加入样品体积3倍的提取液（10% TCA）, 置于-20  过夜；
3、 请于4 ，8000rpm，离心1小时，弃上清，收集沉淀；
4、 沉淀加入等体积的冰浴丙酮，混匀后于4  离心（8000rpm，15分钟），弃上清并真空干燥，保存备用；
5、 上样前加入裂解液（2.7g 尿素，0.2g CHAPS，溶于去离子水中至终体积5ml），混匀后室温放置30分钟，然后4  离心（8000rpm，15分钟），取上清并暂时保存于4  待用。
注：以上标本均应密封保存，4 保存应小于1周，-20 不应超过1个月，-80 不应超过2个月；

操作步骤
实验开始前，各试剂均应平衡至室温，试剂不能直接在37 溶解；试剂或样品配制时，均需充分混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。
1、 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液 100  ，余孔分别加标准品或待测样品100 ，注意不要有气泡，加样 时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37 温育2小时。为保证实验结果有效
性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2、 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液 100 （临用前配制），酶标板加上覆膜，37 温育1小时。
3、 弃去孔内液体，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分钟，大约400 /每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。
4、 每孔加检测溶液B工作液（临用前配制）100 ，加上覆膜，37 温育1小时。
5、 弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤3。
6、 每孔加底物溶液90 ，酶标板加上覆膜37 避光显色（反应时间控制在15-30分钟，当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止）。
7、 每孔加终止溶液50 ，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物    液的加入顺序相同。
8、 立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（ 值）。

注：
1、 试剂准备：所有试剂在使用前应平衡至室温，使用后请立即按照说明书要求保存试剂。实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。
2、 加样：加样或加试剂时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的 “预温育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。一次加样时间（包括标准品及所有样品）最好控制在10分钟内。推荐设置复孔进行实验。
3、 温育：为防止样品蒸发，实验时将加上盖或覆膜的酶标板置于湿盒内，以避免液体蒸发；洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态；同时应严格遵守给定的温育时间和温度。
4、 洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响最后的酶标仪读数。
5、 试剂配制：Detection A及Detection B在使用前请手甩几下或少时离心处理，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配制使用，并使用相应的稀释液配制，不能混淆。请精确 配制标准品及工作液，尽量不要微量配制（如吸取检测溶液A时，一次不要小于10 ），以避免由于不准确稀  释而造成浓度误差；请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液。
6、 反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如，每隔10分钟），如颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。
7、 底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。
    
洗板方法
1、 手工洗板方法：将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内，浸泡1-2分钟，吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体，在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；根据需要，重复此过程数次。
2、 自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。