标题基因检测方法点滴Genetic Testing Protocol

逆转录RT-PCR操作注意事项

RT-PCR操作有三步：
第一，ＲＮＡ提纯；第二，　ＲＴ逆转录；第三，ＰＣＲ聚合酶反应，

（1. ）做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug
（2. ）RT按要求做，一般不会出太大问题。
（3. ）PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。

RT和PCR时的引物设计有3种方法:

a）：Random 9mers；
　　（b）：Oligo dT-Adaptor Primer；
　　（c）：特异的下游引物。如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。 如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？http://www.ncbi.nlm.nih.gov

1.RT-PCR有两种做法：
条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。（promega）。

2.RT-PCR应具备的条件
高质量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。

3.RACE
我做过RACE（3’RACE是宝生物的Kit；5‘RACE是Gibico），但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE的方法），而另一个基因的3’UTR却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故，我都快绿了，有无 RT-PCR的常用内标b－actin 和GAPDH的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺激。

3有关内参的几点建议：

一定要做内参的，每一次，我想。不作内参的结果是不可信的。

（1）半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量；
（2）以电泳为基础的半定量RT-PCR本身是不可信的，作为实验的粗筛是可以的，但不能作为最终结果的；
（3）半定量RT-PCR和定量RT-PCR应该在同一个管中进行，内参基因和目的基因表达率相同，长度差不多，GC含量相似。
我觉得做RT-PCR的方法和条件及应注意的事项总结出几条,　许多专业书都有详细的描述,　但是许多人还是历经多次磨难，有时就是得不出结果。因此，我认为因为每个人所要克隆的片断不同，引物不同等，因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性,　做实验时各人的情况不同,　做不出时还是要好好动一下脑子。

防止RNA酶污染的措施

1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。
4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。
6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。

常用的RNA酶抑制剂

1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。
3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。
4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。
5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。

Real-Time PCR实时定量操作注意事项

实验中养成的一些好习惯

（1） 加入试剂之前,把它混匀一下,以免放置时间长了浓度不均
（2） 移液枪用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性
（3） 一定要记着关水浴箱，切记切记
（4） 多和大家讨论，同时多关注别人讨论的经验，这几乎是最快提高的捷径了
（5） 所有的试剂都自己配，出了问题才好找原因。

一、防止RNA酶污染的措施

1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180度的高温下干烤6hr或更长时间。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。
4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37度处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。
6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。

二、常用的RNA酶抑制剂

1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。
3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。
4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。
5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。

因为DEPc不加选择的修饰蛋白质和RNA，因此在分离和纯化RNA过程中不能使用，而且它与一些缓冲液（例如Tri）不能相容

在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。

RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。

研究人员造成的污染 RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此进行RNA实验时应勤换手套。

但DEPC能与胺和巯基反应,因而 含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理

（一）动植物总RNA提取-Trizol法
　　Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。 RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly（A） 分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。

　　1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。

　　2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。

　　3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。

　　4、弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4度下7500g离心5分钟。

　　5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55度-60度水溶 10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70度。


总mRNA的提取（自己的经验）

一、 关于Trizol Reagent需要的试剂
1． Chloroform：氯仿 （分析纯）
2． Isoproplyl alcohol：异丙醇（分析纯）
3． 75% Ethanol（in DEPC-treated water）:75%乙醇。要求用分析纯无水乙醇并用0.01%的DEPC
　　处理过的无Rnase的水稀释。
4． RNase-free water：无Rnase的水。方法是：将DEPC按0.01%（V/V）加在d H2O中500ml
　　（50ul），在37度过夜，并高压灭菌即得（150度3小时）
5． 一次性塑料手套
6． 注意：DEPC有致癌之嫌

二、 关于Trizol Reagent的使用过程：

Homogenization（匀浆）
　　a. Tissues：组织
　　　每100mg组织匀浆加1mlTrizol试剂，样品体积不能超过Trizol试剂的10%。
　　b. Cells Grown in monolayer（单层细胞接毒后出现病变的）
　　　针对JEV细胞总RNA的抽提法：

BHK21细胞长成单层后，接毒0.5-1ml（采用大瓶），37度吸附1h，倒掉，加维持液（含2%的血清和HEPE8的MEM）约5ml，维持天。出 现75%-100%的病变时，以PBS（预冷）冲洗细胞两次，直接在细胞瓶中加入Trizol试剂1ml/10cm2，吹吸几次，以裂解细胞（细胞瓶有两 种常用规格：大的约45cm2，小的约30cm2，故所用Trizol试剂分别约为4.5ml和3ml。Trizol试剂的加入是依细胞瓶而定，以盖满瓶 底为度，而不是依据细胞的数量，否则可导致DNA的污染）具体方法如下：（样品一定要新鲜）

（1） 组织接入预冷的EP管中，加入Trizol试剂1ml/10cm2（量一定要加足，否则易污染），混匀，吹吸几次，以破裂细胞，置室温5min，以使核蛋白复合物彻底分离。

（2） 加氯仿0.2ml（每1ml Trizol试剂加入氯仿0.2ml），盖好，剧烈震荡15s，置室温2-3分钟。

（3） 4度离心，10000g，15min，离心后，混合物将分离为底层为浅红的、中层为酚-氯仿相、
　　　上层为无色的水相。RNA包含在水相中，水相的体积约相当于所加的Trizol试剂量的60%。

（4） 仔细吸取上层水相，移至另一EP管中。

（5） 加0.5ml异丙醇，以沉淀RNA（每1ml Trizol试剂加入0.5ml异丙醇），置室温10min。

（6） 4度离心，10000g，10min。RNA沉淀为一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁。

（7） 弃上清液，加入预冷的75%乙醇1ml（每1ml Trizol试剂加入75%乙醇至少1ml），震荡，充分洗涤沉淀，4度离心，5500g，5min。弃上清液，空气干燥（或真空干燥）后，沉淀重悬于无 Rnase dH2O中，吹吸几次，55，-60度作用10分钟以溶解RNA，-70度保存备用。

（8） 抽提出的细胞总RNA干燥后加水50ul，取10ul加无Rnase水990ul，稀释100倍成1ml。于0.5cm厚的石英比色杯中，以无Rnase水为对照，在721型紫外分光光度计下检测，结果应为：A260/280 ratio<1.6。

（9） 分离组织10mg（纯组织）加800ul Trizol试剂。

（10） 扩增产物的鉴定

DEPC处理方法如下：

1. DEPC处理

（1）DEPC水：100ml超纯水加入0.2ml DEPC，充分混匀，高压灭菌。

（2）Tip头（枪头）、EP管等在提RNA过程中及做RT时接触RNA的器材（包括1ml、200μl、20μl Tip头；EP管和PCR反应管等）：用0.1%的DEPC水（1000 ml超纯水加入1ml DEPC）37度浸泡过夜，高压灭菌。

2. 提取RNA，用DEPC水溶解

3. RT，我是用PCR仪来控制温度和时间的，所以RT是在PCR反应管中作的。

4. 操作过程中要戴一次性手套，并经常换手套。最好把要直接接触样品的东西都用DEPC水处理一下，枪头盒插好枪头后，加入1-2ml的0.1度C水，在灭菌就行了；现在有进口的RNASE FREE的枪头买，直接用不用处理的。