标题细胞凋亡检测方法---DNA片断化检测

       细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50~300kbp长的DNA大片段, 或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder).细胞经处理后,采用常规方法分离提纯DNA,进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色,在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder.如果细胞量很少,还可在分离提纯DNA后,用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)使DNA标记,然后进行电泳和放射自显影,观察凋亡细胞中DNA ladder的形成.

1. 大分子染色体DNA片段的测定

       细胞凋亡的早期,染色体断裂成为50~300kbp长的DNA大片段.所有超过一定分子量大小的双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同.线性DNA的双螺旋半径超过凝胶半径时,即达到分辨力的极限.此时凝胶不再按分子量的大小来筛分DNA,DNA像通过弯管一样,以其一端指向电场一极而通过凝胶,这种迁移模式称之为"爬行".因此,细胞凋亡早期产生的50~300kbp长的DNA大片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离.通常采用脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题.这个方法是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场.每当电场方向改变后,大的DNA分子便滞流在爬行管中,直至新的电场轴向重新定向后,才能继续向前移动.DNA分子量越大,这种重排所需要的时间就越长.当DNA分子变换方向的时间小于电脉冲周期时,DNA就可以按其分子量大小分开.

参考文献
Brown,D.G., Sun, X.M., ａnd Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039

2. DNA Ladder 测定

方法:收获细胞(1′107)沉淀?细胞裂解液?13000rpm′5min, 收集上清?1%SDS和RnaseA(5mg/ml)56°C,2h?蛋白酶K(2.5mg/ml)37°C,2h?1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积的冷无水乙醇沉淀DNA,4°C过夜?14000rpm′15min?最后将沉淀溶解在TE buffer中,加DNA Loading Buffer?1.2%琼脂糖凝胶电泳,EB染色并照相.

结果图

参考文献 Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid ａnd simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-5507

3. 凋亡细胞DNA含量的流式细胞计分析

方法:收集细胞?70%冷乙醇(in PBS)4°C固定过夜?PBS洗涤,1000rpm′10min?RNase A(0.5mg/ml)37°C消化30min?PI(50mg/ml)染色,室温避光15min?FACScan分析DNA亚二倍体的形成及细胞周期的变化.

结果图

4. ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH)

优点：敏感度高，适合于检测少量样本，小部分凋亡细胞。如临床活组织检测。