标题感受态细胞的制备及转化

目的

掌握感受态细胞制备和转化的基本方法。

原理

受体细胞经过一些特殊方法如电击法, 化学试剂法（CaCl2 ,RbCl，KCl)等的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。

试剂与器材

一、试剂

1、0.1mol/L CaCl₂取20ul PCR产物进行1.2%琼脂糖电泳分析。

2、LB液体培养基（见实验一）

3、LB固体培养基（见实验一）

4、氨苄青霉素（100mg/mL）

二、器材

1、 冷冻离心机

2、 平衡天平

3、 无菌操作台

4、 微量移液器

操作步骤

一.感受态细胞的制备(0.1MCaCl₂方法)

1、从LB固体平板挑单克隆于5ml LB液体培养基中(不加抗生素)，37℃×200rpm×12-16h，可过夜培养。

2、将活化菌体按1`～5％接种到LB中，扩大培养37℃×200rpm×2h，至OD₆₀₀约为0.4。

3、取培养好的菌液1.5 ml于一离心管中，4℃离心8 000rpm×1 min。

4、弃上清，加500 ul 0.1M CaCl₂ (灭菌预冷)洗菌体，4℃冷冻离心8000rpm×1 min。

5、彻底除去残液, 加200 ul 0.1M CaCl₂ (灭菌预冷)，悬浮菌体。

6、冰浴静置 30 min ，4℃冷冻离心8000rpm×1 min。

7、弃上清，加100 ul 0.1M CaCl₂ (灭菌预冷)，悬浮菌体，即为制备好的感受态细胞。

附注：

①、整个过程注意无菌操作和保持低温。

②、培养物处于对数生长期是制备感受态细胞的关键。

③、如果要求高转化效率，不建议使用简单深冻保存的感受态细胞。

④、LB液体培养基建议用不加抗生素和加抗生素的两种培养基，检查菌体是否污染。

⑤、D₆₀₀值指细胞密度，用于判断培养物是否处于对数生长期。OD₆₀₀值在0.4 - 0.5时，此时培养物处于对数生长期，细胞数在20min内加倍。

二、质粒对大肠杆菌的转化

1、将连接产物加入100 ul制备好的感受态细胞，冰上放置30 min。

2、42℃热激90S。

3、迅速冰浴3min。

4、加入300 ul LB液体培养基，37℃轻摇培养45min。

5、加入30 ul X-gal和6 ulIPTG,混匀。

6、取100 ul涂布在含有50 ug/ml氨苄的LB固体培养基中。

7、37℃倒置，避光培养16-20 h。

8、蓝白斑筛选，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定。