10x Genomics 单细胞项目一直是如火如荼，而单细胞悬液制备顺势成为该项目的关键，小编整理了远慕生物 2 年多 10x 项目经验及 10x Genomics 官方网站相关资料，为你带来神秘「单细胞悬液制备」秘籍。
为保证细胞活力，新鲜的样本不能冻存且长距离运输，小编建议提前预约，公司会安排上门建库服务。上机前样本要求如下：
- 细胞浓度：5x105~1.2x106/ml
- 细胞数量：1x105 cells/sample
样本制备的具体方案因样本类型而异，但无论采用哪种方案，都必须确保上样的细胞有活性。对于悬浮细胞系、磁珠富集细胞和流式分选细胞已呈悬浮状态，只需要洗涤和计数即可。固体组织和其他大细胞聚合体必须使用机械或酶解离，细胞分选或其他细胞分离技术解离成单细胞悬液状态。
样本制备一般有什么策略？
- 组织样品须通过酶促解离制成单细胞悬液
- 细胞数量较少（小于 100 000）的样品可适当减少洗涤次数
- 细胞直径过大的样品，可以分离细胞核，制备细胞核悬液
- 植物细胞须去除细胞壁得到原生质体悬液
样本制备应遵循什么原则？
- 建议使大口径枪头重悬，以减少对细胞的损伤
- 每次移液前先混匀细胞悬液，然后从管中部吸取
- 弃上清时注意不要破坏细胞沉淀
- 取样时最好设置两个重复，对每个样品计数 2 次
- 一般选用含 0.04 % BSA（400 μg/ mL）的 1× PBS 溶液重悬和洗涤细胞
- 重悬细胞浓度洗涤和重悬细胞时，总体积浓度不低于 5 000 个细胞/μl；最理想的范围保持在 700～1200 cells/ μL，此浓度下计数较为准确
- 有些细胞如 PBMC 在 PBS 中易成团状，从而降低细胞的有效浓度，因此制备细胞悬液要迅速，最好在 30 分钟内完成
- 最佳上样体积为 2.5 μL～15 μL
样品质量有什么要求？
- 悬液干净、无过多杂质及细胞团
- 细胞存活率>90%（比较难处理的样本可以放宽至>80%）
- 细胞直径<40 um
若单细胞悬液中存在死亡或垂死细胞，细胞团，细胞碎片，游离 mRNA 会导致：
- 细胞捕获率低
- 低文库复杂性（UMI 检出率下降/gene 表达量低）
- 有效细胞 reads 数低
- cDNA 得率偏低
如何获取高质量样品？
1. 细胞清洗：
推荐的洗涤悬浮液为含 0.04％ BSA 的 PBS，至少洗涤一次，减少细胞损失或聚。
原代细胞，干细胞和其他敏感细胞类型需最大细胞活力，必要时可用常见细胞缓冲液替换 PBS。
2. 细胞过滤：
细胞团或细胞碎片会增加微流体芯片的堵塞风险。为避免这种状况，建议在上样前使用细胞滤网（cell strainer），孔径大约为 30～40 μm，进行过滤。
低细胞悬浮液体积建议使用 Flowmi™Tip 过滤 , 样品体积损失小，细胞浓度降低 30% 左右。
常规体积建议使用 MACS SmartFilter 过滤，样品体积损失 100 ul 左右，细胞浓度影响不大。
3. 准确测定细胞活力
4. 组织优化分离方案
适宜制备时间
适宜分离条件（时间/温度/酶类型和浓度/离心转速、温度、时间）
5. 大口径移液管对细胞进行吹打，避免造成细胞损伤。
细胞计数有什么策略？
计数结果干扰会过低或过高估计细胞存活率，细胞上样浓度一般：700～1200 个细胞/µl 的范围。在第一次表征样品类型时，建议进行两种不同的方法计数和活力测定。
- 台盼蓝染色法，操作简单，但小细胞难以准确计数及活力测定
- 荧光染料染色法，结果相对直观，计数和活力准确
如果，细胞数<100 000，样本制备应该注意什么？
- 样品分选至合适培养基
- 清洗前进行一次计数
- 水平离心机离心，PBS 至少清洗一次
温馨小提示：此「单细胞悬液制备」秘籍仅供参考，各位老师还需根据实际样本选择适合的单细胞悬液制备方案。
