无缝克隆又叫同源重组，它可以将单个至多个片段同时插入到一个载体中，而不需要进行多次的酶切和纯化。通常情况下，无缝克隆可以在 5-15 min内完成多个片段的连接，其克隆阳性率高达 98% 以上。但需要注意的是，我们在无缝克隆前进行 PCR 扩增的时候，载体与片段之间、片段与片段之间需有 15-20 碱基的一段同源序列，这是为什么呢？因为我们无缝克隆的试剂盒里面存在三种酶，分别是 T5 核酸外切酶、DNA 聚合酶、DNA 连接酶。其中 T5 核酸外切酶具有 5’-3’核酸外切酶的活性，能够将序列从 5’-3’开始降解，此时暴露出载体以及片段的3’同源序列，经过碱基互补配对，DNA 聚合酶添加缺失碱基后由 DNA 连接酶将片段与载体进行连接，从而达到载体重组的功能。因此，如果不添加同源序列，载体与片段、片段与片段之间将无法进行连接。
无缝克隆引物设计大家现在对无缝克隆已经有一个深入的了解了，那么我们来看看，在做无缝克隆之前，跑 PCR 的时候引物设计有哪些要求呢？
引物添加的顺序 5’-3’：
同源序列+特异性引物（克隆后无需进行酶切，适用于表达载体）
同源序列+保护碱基+酶切位点+特异性引物（克隆后还需要进行酶切或者亚克隆）这里需要提醒大家注意一下，由于无缝克隆的引物在普通 PCR 的引物基础上添加了额外的附加碱基（同源序列、保护碱基、酶切位点），Tm 值可能会较常规引物的高。但我们在做 PCR 的时候，第一、二次循环，几乎只有特异性引物的序列与模板结合，此时应该只计算特异性引物的 Tm 值，否则会出现退火温度过高，PCR 扩增不出条带。但后面的循环，特异性引物和附加碱基均能够和第一、二次扩增产物为模板进行结合扩增，并占据绝对优势。此时引物 Tm 值应该按照整条引物的 Tm 值计算。因此，在做无缝克隆前的 PCR 扩增时，建议大家在第二个循环后提高退火温度进行 PCR 扩增，更有利于产物的形成。
无缝克隆的连接时间的选择虽然说，无缝克隆带给我们很多的便利，但小编需要告诉大家需要注意一点儿的是，无缝克隆连接的片段数量有限，一次连接超过 6 个或者载体+片段超过 13 Kb 后，其连接时间会增加且阳性率会降低，甚至出现实验失败的情况。因此，在做无缝克隆实验的时候需要多多计算一下。
