标题DEAE—离子交换剂纯化血清IgG使用步骤及注意事项

DEAE-纤维素（Diethylaminoethyl-cellulose，DEAE）是在纤维素上引入二乙基氨基乙基，属于弱碱型阴离子交换剂。吸附蛋白质的最适pH范围为7～9，pH超过9.5，DEAE基团则不解离带电荷。每克DEAE含0.96～1.24mmol/L可解离基团，与蛋白质的交换量可75-122mg/100mgDEAE。

    应用离子交换剂来纯化物质，可以是把要纯化的物质成分交换吸附于离子交换剂上，然后再分别洗脱下来获得纯品，或者把不需要的成分吸附于离子交换剂上，需要的成分直接流出，得到纯品。本实验采用DEAE-纤维素层析柱纯化血清IgG，利用pH6.7的缓冲液溶解样品IgG，此时IgG粗物中除IgG外，其他杂蛋白均带上不同数量的负电荷，可以和DEAE上的阴离子发生交换吸附于柱上。IgG因不解离带电，而不发生交换吸附，利用此特点，让溶解后的样品流过DEAE纤维素柱，即可直接收集到较纯的IgG。

    （一）试剂及器材

    1.   0.0175mol/L， pH6.7，磷酸盐缓冲溶液

    2.   奈氏试剂。

    3.   20%（W/V）磺基水杨酸溶液。

    4.   1cm×50cm

    5.   黑、白比色磁盘。

    （二）操作步骤

    1．活化

    根据所需层析柱的柱床体积计算所需DEAE的用量，称取所需DEAE用蒸馏水浸泡过夜，其间换几次水，每次除去细小颗粒。抽干，改用0.5ml/L NaOH溶液浸泡1h以上，抽干（可用布氏漏斗），用无离子水漂洗，使pH至8左右（用pH试纸检查）。再改用0.5ml/L HCl溶液浸泡1h以上，去酸溶液，用无离子水洗至pH6左右。然后用0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，浸泡平衡后使用。

    2．装柱

    用0.0175mol/L，pH6.7，磷酸盐缓冲溶液浸泡已处理好的DEAE-纤维素，并更换1～2次。然后搅拌均匀，灌入层析柱中，直至纤维素柱床高约17cm左右为止。柱床形成后，在洗脱瓶装入0.0175mol/L pH6.7磷酸盐缓冲溶液，接在层析柱上口，打开柱下端出口，使磷酸盐缓冲溶液流过纤维素，直至流出液的pH值与磷酸盐缓冲溶液的pH值完全相同（用pH试纸不断检查）为止。

    3．上样 

    上述平衡过程完毕后，关闭柱下口。用滴管吸去纤维素柱面上的深液（但不能低于柱下口），控制流速使样品慢慢进入纤维素内。待全部样品进入柱后，在柱床面上加一层0.0175mol/L  pH6.7 磷酸盐缓冲溶液。

    4．洗脱

    连接洗脱瓶，打开柱下口开始洗脱。控制流速为0.5ml/min， 用试管收集洗脱液，每管10滴。从每滴中取1滴收集液放入在黑色比色盘孔中，加入1滴20%磺基水杨酸检查是否产生白色沉淀。在此条件下在收集液中首先出现的蛋白质即为纯化的IgG。因此，从洗脱开始就应收集洗脱液，直至收集液中无蛋白质出现为止（加磺酰水杨酸不呈白色沉淀），合并含有蛋白质的各管收集液中无蛋白质即为纯化的IgG溶液。

    5．再生 

    用过的离子交换剂可以反复使用，使其恢复原状的方法俗称“再生”。 由于DEAE-纤维素使用后因带有大量杂蛋白，所以再生时，先用0.5ml/L NaOH浸洗，用无离子洗至pH8左右，然后用0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲溶液浸泡即可转型再使用。

    6．鉴定 

    纯化后获得的蛋白质样品均应进行鉴定后方能证明产品的合格性。