标题中海羊大肠杆菌培养基制备六大步骤解析

Ⅰ、冻存液的制备

将含有足够菌量的液体培养基进行离心后，沉淀过程中加入等量的40%甘油，置于-80°C冷冻。

Ⅱ、培养基制备

LB培养基配方：胰蛋白胨Trypton：10 克/升、酵母提取物YeastExtract：5 克/升、氯化钠NaCl：10克/升、 pH7.4。

液体培养基：胰蛋白胨10克、酵母粉5克、氯化钠 10克、水1000毫升、 pH7.4。

固体培养基：在液体培养基的基础上加入1.5%~2.0%琼脂

Ⅲ、平板的制备

⒈称取10.0 g胰蛋白胨、5.0g酵母粉、10.0g氯化钠，加800mL二次水溶解，用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L NaOH调节pH至7.4左右，定容至1L，调节pH至7.4 如果溶液pH大于7.4，用1mol/LHCl调节。

⒉分装到实验锥形瓶中。1300-1930-979每瓶放入用量不宜过多，应在瓶底下方二厘米左右。如果需要固体培养基，分装后在液体培养基中加入约2%琼脂，即150毫升中 海液体培养基中加入2.5g琼脂。

⒊用塑料薄膜盖住锥形瓶口依次将滤纸透气孔和硬纸，用橡皮筋扎好。用记号笔标明培养基名称和制备日期，所有锥形瓶的操作如上所述。

⒋中海使用121°C高压灭菌15分钟。

⒌取出灭菌培养基放置置于60℃电鼓风干燥机中烘干，等锥形瓶封口纸干燥后取出。液体培养基可以直接储存使用。因琼脂培养基不会凝固。您可以通过紫外线消毒三十分钟以上的无菌操作平台上，把中＇海培养基倒入在培养皿中约4mm厚度约10-15mL，直径90mm，将培养皿堆叠在无菌操作台上并放置约十分钟。然后等琼脂基本凝固后，就能涂抹到平板上了。

⒍如果平板不是即时使用，需把中海培养基灭菌后存放在锥形瓶中。当需要平板制备时，在微波炉中用中火档位加热约三分钟易融化琼脂，室温环境冷却二十分钟确保不烫手再进行制备平板。

Ⅳ、接种大肠杆菌

①取实验室保存的大肠杆菌BL21冻存液，用酒精灯灼烧管口，打开离心管。

②接种方法1：用无菌移液器吸头蘸取冻存液，在板边缘画条横线，每三个车道为组，将盘子旋转次，后在中间画个锯齿形；接种方法2：用吸管吸取100uL溶液放在平板上，用酒精灯消毒的厚涂片棒划十字涂在平板上。

③因为实验般需要挑取单个菌落，涂抹平板的操作需考虑冷冻液中细菌的数量。若菌量过多，应适当稀释。通常方法更容易获得单个菌落，涂抹平板应靠近酒精灯操作。如果平板上涂有冷冻保存液，应将其倒置以防止平板表面产生水蒸气。

Ⅴ、羊大肠杆菌的培养

①将接种板倒置，置于37℃恒温培养箱中。约十小时后菌落生长。

②挑出生长状态良好、特征明显的单菌落，接种于新鲜灭菌的中.海LB液体培养基中，220转/分+37℃恒温振荡培养9~12小时。菌落呈乳白色和圆形特征，菌落边缘整齐，表面光滑，表面颜色与背面颜色样。