标题淋巴细胞转化实验

T淋巴细胞表面具有植物血凝素（PHA）和刀豆蛋白（ConA）等非特异性有丝分裂原受体,在体内或体外遇到有丝分裂原刺激后,可转化为淋巴母细胞,依其细胞转化程度可测定T细胞的应答功能,称为淋巴细胞转化试验.
[实验原理]
T淋巴细胞表面具有植物血凝素（PHA）和刀豆蛋白（ConA）等非特异性有丝分裂原受体,在体内或体外遇到有丝分裂原刺激后,可转化为淋巴母细胞,依其细胞转化程度可测定T细胞的应答功能,称为淋巴细胞转化试验.
淋巴母细胞的主要特点：
（1）形态学改变:细胞体积明显增大,为成熟淋巴细胞3-4倍.核膜清晰,核染色质疏松呈网状.核内见明显核仁1-4个.胞浆丰富,嗜碱性,有伪足样突出.胞浆内有时可见小空泡.
（2）细胞内核酸和蛋白质合成增加.
（3）细胞代谢功能旺盛.
利用淋巴母细胞的不同特点,目前有多种实验方法可用于淋巴细胞转化程度的检测.根据其形态学改变,可通过体内法和体外法检测；根据细胞内核酸和蛋白质合成增加的特点,可通过 3 H-TdR 掺入法检测；根据细胞代谢功能旺盛的特点,可通过MTT法进行检测.
一、淋转试验形态学检查法（体内法）
[实验原理]
在体内,当外周血T淋巴细胞遇到PHA 或ConA后可发生转化形成淋巴母细胞,通过采集外周血涂片染色,镜下计数100-200个淋巴细胞,计算其转化率.转化率高低可反映机体细胞免疫水平, 因此常作为检测细胞免疫功能的指标之一.形态学方法简便易行,但结果受操作和主观因素影响较大.
[实验材料]
1. ConA 溶液：根据ConA的纯度配制成最适浓度,一般为0.3-0.5mg/ml.
2.姬姆萨染液或瑞氏染液.
3.玻片、离心机、显微镜、计数器等.
[实验方法]
1.实验前3天,每只小鼠腹腔注射ConA0.3-0.5毫克.
2.3天后,通过摘除小鼠眼球采集外周血,加入预先加有肝素的试管中.
3.涂片:取1小滴抗凝血滴在玻片中央,用推片将血液涂开.自然干燥.
4.固定:取甲醇1-2滴滴在涂片上,自然干燥.
5.染色:加姬姆萨或瑞氏染液2滴于涂片上,同时加2滴水,用吸管水平涂开,使染液均匀覆盖涂抹面,染色时间为5-10分钟.
6.自来水细水冲洗染液,然后用吸水纸轻轻吸干玻片上的液体.
7.显微镜观察结果,计数淋巴转化细胞,计算转化率.
[实验结果]
转化过程中,常见的细胞类型有：淋巴母细胞、过度型淋巴母细胞、核分裂相细胞和成熟淋巴细胞等.计数时,过度型淋巴母细胞和核分裂相细胞亦作为转化细胞.
转化率=转化的淋巴细胞数/（转化的淋巴细胞数+未转化的淋巴细胞数）×100%

二 淋转试验3H-TdR掺入法
[实验原理]
T淋巴细胞受 ConA或PHA激活后,进入细胞周期有丝分裂.当进入细胞周期S期时,细胞合成DNA量明显增加,在培养基中加入氚（3H）标记的DNA前身物质胸腺嘧啶核苷（TdR）,则3H-TdR 被作为合成DNA的原料被摄入细胞,掺入到新合成的DNA中.根据同位素掺入细胞的量可推测淋巴细胞对刺激物的应答水平.掺入的同位素3H,经液体闪烁测量法测出,将3H每分脉冲数（cpm）加以计算,用不同公式表示结果.
同位素掺入法淋转试验,较之形态学方法更为客观、准确,重复性也好,但需一定设备条件.
[实验材料]
1.1640 培养液
2.ConA ：根据ConA 的纯度配制成最适浓度,一般为5-10μg/ml .
3.脂溶形闪烁液：
POPOP（1,4 双（5-苯基恶唑基-2）苯0.4g
PPO[2, 5二苯基恶唑]4g
无水乙醇 200ml
二甲苯 800ml
POPOP 先用少量二甲苯置 37 ℃ 水浴溶解后,再补足其他成分即可.
4.3H-TdR（市售商品）：临用前用培养液稀释成10μCi/ml .
5.多头细胞收集仪、玻璃纤维滤纸、样品杯,液体亲烁计数器等.
[实验方法]
1.无菌分离淋巴细胞（同E花环）,用1640培养液调制成1X106/毫升,加入96孔培养板,每孔100μl.
2.每孔加 ConA 100μl,每个样品加3孔,另3孔不加ConA作对照.37℃培养约56小时.
3．结束培养前加入3H-TdR0.5-1.0μCi/孔.
4.继续培养6-12小时后,用多头细胞收集仪将细胞收集于玻璃纤维滤纸上.
5.烤干后,将滤纸放入闪烁杯中,每杯加闪烁液5毫升,液闪仪测定各管cpm .
[实验结果]
将ConA刺激组和对照组各自的平均cpm值,代入下列公式计算ConA刺激指数（index of stimulation, SI）
SI=ConA 刺激管的cpm均值/对照管的cpm均值
三 淋转试验 MTT 法
[实验原理]
MTT法（四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法）是Mosmann1983年报告的.原理是活细胞内线粒体脱氢酶能将四氮唑化物（MTT）由黄色还原为兰色的甲肷,后者溶于有机溶剂（如二甲基亚枫、酸化异丙醇等）,甲肷产量与细胞活性成正比.可在560nm处用酶标仪测定其OD值.
[实验材料]
1.MTT:PBS配制成5毫克/毫升的储存液,过滤除菌后冻存.
2.溶剂:DMSO、10%SDS、0.04的盐酸-异丙醇.
3.酶标仪
[实验方法]
1.无菌分离淋巴细胞（同E花环）,用1640培养液调制成1X106/毫升,加入96孔培养板,每孔100μl.
2.每孔加ConA100μl,每个样品加3孔,另3孔不加ConA作对照. 37℃培养约56小时.
3.结束培养前加入20μl/孔.继续培养6小时左右.
4.2000转/分钟离心10分钟,弃上清.
5.每孔加 100μl溶剂,轻微震荡使甲肷产物溶解.
6.在酶标仪上波长560nm测定OD值.
[实验结果]
SI=ConA刺激管OD均值/对照管OD均值.
[注意事项]
1.淋巴细胞要新鲜制备,否则会影响实验结果.
2.ConA 刺激时间要根据淋巴细胞转化情况决定,一般为55-66小时.