标题DNA核酸浓度的测定实验应用方案（超微量紫外分光法）

引言

寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA可以定量溶于缓冲液，构成核酸的嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使核苷核和核酸在紫外线光具有特征性的吸收光谱，大吸收峰为260nm。窄光带紫外分光光度计，长260nm．，比色杯光径1cm，1个吸光度值（1A）相当于50ug/ml双螺DNA，40ug/ml单螺旋DNA或RNA），20 ug/ml寡核苷酸。

测试，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。然而，实验并非帆风顺。读数不稳定可能是实验者头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。

原理

紫外分光光度法基于DNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，DNA/RNA在260nm处有大的吸收峰，蛋白质在28Onm处有大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光测定核酸浓度，OD值为1相当于大约50ug/ml双链 DNA，单链DNA浓度约为33ug l ml，RNA约为40ug/ml，寡核苷酸约为35ug/ml。如用1cm光径，用 H,O稀释DNA/RNA样品n倍并以H,O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释的浓度:

DNA (mg/ml ) =50×OD260 读数×稀释倍数/1000RNA (mg/ml) =40×OD260读数×稀释倍数/1000。

A280nm是蛋白和酚类物质高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估:纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。假如比值低，表示受到蛋白（芳香族)或分类物质的污染，需要纯化样品。比值=1.5相当于50%蛋白质/DNA溶液。A230nm是碳水化合物高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估:纯DNA和RNA的A260/A230比值为2.5。若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。

A320nm或A340nm为检测溶液样品的浊度，该值应该接近0.0。假如不足，标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。

仪器及试剂

UL-1000超微量紫外可见分光光度计

比色杯

样本DNA

双蒸水

测定

1、将制备的DNA悬浮溶解于TE缓冲液中 pH8.0，10mmo1L的Tris缓冲液，内含(1mmol/L EDTA)或悬浮溶解在灭菌水中(依据DNA含量加水)。

2、用可扫描的紫外分光光度计测定制备的DNA/RNA的紫外吸收曲线，测定OD260和OD280，并计算比值:OD260/OD280，纯 DNA的此比值约为1.8~2.0。纯RNA的此比值

约为大于2.0。

3、根据每毫升1微克的纯DNA的OD260值=0.020，计算所得 DNA的纯度:每毫升1微克的纯RNA的OD260值=0.025，计算所得RNA的纯度。

注意事项

OD值范围应该在0.1~0.99之间，否则不符合上述线性关系。

A260/A280比值可提供DNA纯度的个参考，但A260/A280比值会受pH影响。如果未调pH，比值可能与实际近期将陆续推出批全新的分析类仪器。差别很大。如果需要准确数值，建议在10 mM Tris Cl，pH 8.5中检测，此时纯净的 DNA A260/A280比值应为1.8-2.0（注意应使用同样缓冲液作为对照)

在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用pH值定、离子浓度较低的缓冲液，如TE，可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值好在0.1-1.5A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的小体积等多个操作事项。

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