标题UL-1000超微量可见分光光度计测RNA质量检测应用方案

UL-1000超微量可见分光光度计测RNA质量检测应用方案

简介

核糖核酸(缩写为RNA，即RibonucleicAcid)，存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种，即A腺嘌呤、G鸟嘌呤、C胞嘧啶、U尿嘧啶，其中，U(尿嘧啶)取代了DNA中的T。

原理细胞中的RNA可以分为信使RNA、转运RNA和核糖体RNA三大类，不同组织总RNA提取的实质就是将细胞裂解，释放出RNA，并通过不同方式去除蛋白，DNA等杂质，终获得高纯度RNA产物的过程。

仪器及试剂

美析UL-1000超微量可见分光光度计

离心管 离心机 电泳槽 凝胶板

细胞样品
RNA提取试剂盒 荧光定量PCR Mix TRIZOL dNTP 氯仿 逆转录酶MMLV 异丙醇 Taq酶 DEPC水 ddH2O TE MgCl2 琼脂糖 溴化乙锭 MOPS 甲醛 乙酸钠 EDTA EB 溴酚兰
样品RNA的抽提
 1.  取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
 2.  两相分离 每1 ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12 000 rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
 3.  RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12 000 rpm 离心10分钟。此时离心不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
 4.  RNA清洗 移去上清液，每1 mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7 000 rpm离心5分钟。
 5.  RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
 6.  溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水4 0ul用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
RNA质量检测
1.紫外吸收法测定
 先用稀释用的TE溶液将紫外分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。
 （1）浓度测定
 A260下读值为1表示40 ug RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 x 稀释倍数 x 40 ug/ml。具体计算如下：

 RNA溶于40 ul DEPC水中，取5 ul，1:100稀释至495 ul的TE中，测得A260 = 0.21

 RNA 浓度= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml 或 0.84 ug/ul

 取5 ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 ul，剩余RNA总量为：

 35 ul x 0.84 ug/ul = 29.4 ug

 （2）纯度检测
 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
 2.  变性琼脂糖凝胶电泳测定
 （1）制胶
 1g琼脂糖溶于72 ml水中，冷却至60℃，10 ml的10 x MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
10x MOPS电泳缓冲液

浓度     成分

0.4 M  MOPS，pH 7.0

0.1 M  乙酸钠

0.01 M  EDTA
 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1xMOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

 （2）准备RNA样品
 取3 ugRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10 ug/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。

 （3）电泳
 上样凝胶须预电泳5 min，随后将样品加入上样孔。5-6 V/cm电压下2 h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3 cm。
 （4）紫外透射光下观察并拍照
 28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。

结果计算

RNA得率有很强的组织特异性，不同组织RNA的丰度和RNA提取的易难程度共同决定了该种组织的RNA得率。一般来说，可通过分光光度计测定RNA溶液在260nm处的吸光值来计算RNA的含量。RNA溶液在260、320、230、280nm下的吸光度分别代表了核酸、溶液浑浊度、杂质浓度和蛋白等有机物的吸收值。用标准样品测得在波长260nm处，1ug/mlRNA钠吸光度0.025（光程为1cm），即OD260=1时，样品中RNA浓度为40ug/ml。通常分光光度计OD260的读数要介于0.15-1.0之间才是可靠的。因此RNA提取结束后，要根据大概产量稀释到适当浓度范围，再用分光光度计检测。按下面的共识计算总RNA浓度：

总RNA浓度（ug/ml）=OD260×稀释倍数×40ug/ml