标题金黄色葡萄球菌检验

 【GB/T 4789.10?1994】
食品卫生微生物学检验　金黄色葡萄球菌检验

　　1　主题内容与适用范围
　　本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌的检验方法。
　　本标准适用于食品和食物中毒样品中金黄色葡萄球菌的检验。
　　2　引用标准
　　GB 4789.28　食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂
　　3　设备和材料
　　3.1　显微镜。
　　3.2　温箱：36±1℃。
　　3.3　离心机。
　　3.4　灭菌吸管：1mL、10mL。
　　3.5　灭菌试管。
　　3.6　灭菌平皿。
　　3.7　均质器。
　　3.8　载玻片。
　　3.9　L型涂布棒。
　　3.10　酒精灯。
　　3.11　接种环。
　　4　培养基和试剂
　　4.1　胰酪陈大豆肉汤：按GB 4789.28中4.59规定。
　　4.2　7.5%氯化钠肉汤：按GB 4789.28中4.61规定。
　　4.3　血琼脂平板：按GB 4789.28中4.6规定。
　　4.4　Baird－Prker琼脂平板：按GB 4789.28中4.60规定。
　　4.5　肉浸液肉汤：按GB 4789.28中4.1规定。
　　4.6　灭菌盐水。
　　4.7　兔血浆：按GB 4789.28中4.63规定。
　　5　检验程序
　　金黄色葡萄球菌检验程序如下：
　　（图略）
　　6　操作步骤
　　6.1　增菌培养法
　　6.1.1　检样处理
　　称取25g固体样品；吸取25mL液体样品，加入225mL灭菌生理盐水，固体样品研磨或置均质器中制成混悬液。
　　6.1.2　增菌及分离培养
　　吸取5mL上述混悬液，接种于7.5%氯化钠肉汤或胰酪陈大豆肉汤50mL培养基内，置36±1℃温箱培养24h，转种血平板和Baird－Parker平板，36±1℃培养24h，挑取金黄色葡萄球菌菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。
　　6.1.3　形态
　　本菌为革兰氏阳性球菌，排列是葡萄球状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌菌体较小，直径约为0.5～1μm。
　　6.1.4　在肉汤中呈混浊生长，在胰酪陈大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长，血平板上菌落呈金黄色，也有时为白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。在Baird－Parker平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径为2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。
　　6.1.5　血浆凝固酶试验
　　吸取1∶4新鲜兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0.5mL，振荡摇匀，放36±1℃温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。
　　6.2　直接计数方法
　　6.2.1　吸取上述1：10混悬液，进行十倍递次稀释，根据样品污染情况，选择不同浓度的稀释液1mL，分别加入三块Baird－Parker平板，每个平板接种量分别为0.3mL、0.3mL、0.4mL，然后用灭菌L棒涂布整个平板。如水分不多吸收，可将平板放在36±1℃温箱1h，等水分蒸发后反转平皿置36±1℃温箱培养。
　　6.2.2　在三个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落，并从中任选5个菌落，分别接种血平板，36±1℃24h培养后进行染色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培养法。
　　6.2.3　菌落计数：将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数，除以5，再乘以稀释倍数，即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数。
　　
　　　　　　　　　　　　　　　　附录A
　　　　　　　　　　　　葡萄球菌肠毒素检验
　　　　　　　　　　　　　　　（参考件）

　　A1　设备和材料
　　A1.1　均质器。
　　A1.2　冰箱。
　　A1.3　离心机。
　　A1.4　分液漏斗。
　　A1.5　透析袋。
　　A1.6　振荡培养箱或普通温箱：36±1℃。
　　A1.7　灭菌吸管：1mL、10mL。
　　A1.8　电线。
　　A1.9　载玻片。
　　A1.10　三角瓶：250mL。
　　A1.11　直径150mm大平皿（或带盖搪瓷盘）。
　　A1.12　玻璃纸。
　　A1.13　镊子。
　　A1.14　三角棒。
　　A1.15　直径2.5mm打孔器。
　　A1.16　有机玻璃模板。
　　A1.17　橡皮圈。
　　A1.18　细滴管。
　　A1.19　层析柱：40mm×20～25mm。
　　A1.20　酶标测定器。
　　A1.21　洗瓶。
　　A1.22　微量加样器：200mL、50mL。
　　A2　培养基和试剂
　　A2.1　肠毒素产毒培养基：按GB 4789.28中4.87规定。
　　A2.2　营养琼脂。
　　A2.3　1%琼脂糖（0.9%生理盐水配制）溶液。
　　A2.4　0.2mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液。
　　A2.5　三氯甲烷。
　　A2.6　6mol/L盐酸溶液。
　　A2.7　5mol/L氢氧化钠。
　　A2.8　生理盐水。
　　A2.9　1%乙酸溶液。
　　A2.10　0.1%噻嗪红R或氨基黑B。
　　A2.11　硅胶或凡士林。
　　A2.12　A、B、C、D型葡萄球菌肠毒素和抗血清。
　　A2.13　羧甲基纤维素（CM22或CM11 Whatman）。
　　A2.14　0.008mol/L pH5.6磷酸盐缓冲液。
　　A2.15　0.008mol/L pH6.8磷酸盐缓冲液。
　　A2.16　酶标记A、B、C、D肠毒素抗血清或酶联免疫试剂盒。
　　A2.17　0.1mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液。
　　A2.18　0.05%0.02mol/L pH7.2吐温－20缓冲液。
　　A2.19　邻苯二胺酶底物。
　　A2.20　2 mol/L硫酸。
　　A3　检验程序
　　A3.1　从菌株中检测肠毒素
　　从菌株中检测肠毒素程序见图A1：
　　（图略）
　　A3.2　从食物检样中提取和检测肠毒素
　　A3.2.1　微玻片法检测肠毒素（浓缩法层析法）程序见图A2：
　　（图略）
　　A3.2.2　酶联免疫法检测肠毒素程序见图A3：
　　（图略）
　　A4　肠毒素检测
　　A4.1　从菌株中提取肠毒素方法
　　A4.1.1　液体透析培养法：用宽2.5cm、长80cm的透析袋装入60mL产毒培养基，两端扎紧，将透析袋装入250mL三角瓶内，加入15mL灭菌生理盐水，透析袋两端留在瓶口，用棉塞塞好，121℃高压灭菌30min，待测的菌株接种营养琼脂斜面（试管18mm×180mm），37C培养24h，用生理盐水5mL，洗下菌落，倾入上述培养瓶中，每个菌种种一瓶，37℃振荡培养48h，振速为100次/min。吸出菌液离心，8000r/min
30min，取上清液做双相琼脂扩散，如为阴性，再装入透析袋内，用电风扇吹，或用多聚乙二醇，浓缩至1～2mL，再做琼脂扩散。
　　A4.1.2　固体透析培养法：向直径150mm的灭菌平皿或带盖搪瓷盘中倾入灭菌产毒培养基约100～120mL，凝固后表面铺一灭菌玻璃纸，待测菌株接种在营养琼脂上，37℃培养24h，用约3mL灭菌盐水洗下菌苔，倾在玻璃纸上，用灭菌三角棒涂满平皿，37℃培养48h，加入10～20mL灭菌生理盐水，用灭菌三角棒刮取菌苔，吸取菌液离心，以下步骤同液体透析培养法。
　　A4.2　从食品中提取肠毒素方法
　　A4.2.1　直接浓缩法：取食品样品100g，加入无菌0.2mo1/L
pH7.5磷酸盐缓冲液，均质成匀浆，置4℃浸泡18～24h，用纱布过滤将滤液离心8000r/min20min，取上清液，放入分液漏斗中，加入10mL三氯甲烷，振摇10min，静置，将底层三氯甲烷弃去（如不分层，可8000r/min离心20min）。加入6mol/L盐酸溶液调pH至4.5，8000r/min离心20min，取上液，加5mol/L氢氧化钠溶液，调pH至7.5，离心取上清液，装入透析袋或玻璃纸，用电扇吹干，或放多聚乙二醇上浓缩至1～2mL，做微玻片双向琼脂扩散。
　　A4.2.2　层析法：如需提取较纯肠毒素，可将上述浓缩液用蒸馏水洗下，装入透析袋，以0.008mol/LpH5.6磷酸盐缓冲液平衡，加入CM层析柱内，流速1～2mL/min，用0.008mol/L
pH5.6磷酸盐缓冲液洗脱，再用0.2mol/LpH6.8磷酸盐缓冲液洗脱出肠毒素。洗脱液装入透析袋内，用电扇或多聚乙二醇浓缩至1mL，做微玻片双向琼脂扩散，检测肠毒素。
　　A4.3　双向琼脂扩散检测肠毒素
　　A4.3.1　微玻片法：将在95%乙醇中浸泡的载片用洁净纱布擦干，吸取溶化的0.2%琼脂糖（蒸馏水配制）滴在载玻片上，使剩余的琼脂糖流下，放无尘的环境中干燥，先将一层薄塑料板放在载玻片上，然后将带孔的有机玻璃模板边缘涂一层薄的硅胶或凡士林，放在塑料板上，两边用橡皮圈系紧固定，吸取1%琼脂糖，立即从模板中间孔加入载玻片和模板之间，直至充满琼脂糖，凝固后再将孔中琼脂糖用注射器针头挑去，在中间孔滴加抗血清，四周滴加菌株产毒液或食品提取液，放入加有湿棉球的容器内，放25～30℃18～24h观察结果。可在灯光上，并对着暗的背景观察，在抗血清和提取液之间呈现明显沉淀线。如沉淀线只能微弱可见时，可进行染色。
　　A4.3.2　玻片法：吸取溶化的1%琼脂糖2.5mL，铺在洁净载玻片上，凝固后用直径2.5mm的金属打孔器打成幅射型，孔距为2.5mm，中心孔加入肠毒素抗血清，周围六个孔加入菌株或食品的肠毒素提取液，放入有滴加2/10000三氮化钠湿棉球的容器内，以保持湿度。置25～30℃18～20h，观察结果，在抗血清的提取物之间有明显沉淀线即为阳性。
　　A4.3.3　染色法：用微玻片法取下胶带和有机玻璃模板，玻片法可直接将玻片放入蒸馏水中浸泡4～8h，中间换2～3次水，在下述各液中浸10min，10%乙酸中含1%噻嗪红R（或氨基黑）；1%乙酸；1%乙酸含1%甘油，如脱色不净，可继续浸泡。取出后盖一滤纸，吸去多余液体，在室温或35℃烘干。阳性者沉淀被染料颜色，可长期保存。
　　（图略 ）
　　A4.4　酶联免疫法检测肠毒素（双抗体法）
　　A4.4.1　包被抗体：用0.1mol/LpH9.5碳酸盐缓冲液稀释肠毒素抗血清使成5μg/mL，加入洗净的苯乙烯凹孔板内，每孔0.2mL，置36±1℃30min，弃去上液。
　　A4.4.2　洗涤：用0.05%0.02mol/LpH7.2吐温－20缓冲液洗涤5次。
　　A4.4.3　加入检样：如为液体，可直接加入0.2mL，固体样品取100g，加入0.2mol/LpH7.5磷酸盐缓冲液100mL，均质后取过滤液0.2mL。
　　A4.4.4　洗涤：同A4.4.2。
　　A4.4.5　每孔内加入酶抗体0.2mL，置36±1℃30min，同时做阳性和阴性对照。弃去上液。
　　A4.4.6　洗涤：同A4.4.2。
　　A4.4.7　每孔内加入邻苯二胺酶底物溶液0.2mL，室温放置30min。
　　A4.4.8　每孔内加入2mol/L硫酸0.05mL，立即放酶标仪比色。
　　A4.4.9　结果判定：样品OD值比阴性对照，比值大于2为阳性，小于2为阴性。
　　附加说明：
　　本标准由卫生部卫生监督司提出。
　　本标准由北京市卫生防疫站负责起草。
　　本标准主要起草人刘以贤。
　　本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。