摘要：
亲和标签已成为后基因组学时代纯化重组蛋白常用手段。此方法无需了解蛋白质的生化特性或生理活性，就可通过带标签的重组融合蛋白选择性地与层析基质上的配体结合，从而得以纯化任何蛋白质。此方法与常规的层析方法不同之处在于，针对不同的蛋白质需要开发特定的配体和方法。采用保护蛋白质结构和功能完整性的温和条件，已成功地通过一步亲和层析从粗提物中纯化出了多种重组蛋白，纯度达90％以上。（Arnau et al. 2006）。
然而，对于蛋白质的结构研究和治疗或诊断试剂的应用，我们期望获得天然的无标签蛋白，以避免亲和标签所带来的潜在干扰（Arnau et al. 2006, Bucher et al. 2002）。因此需要用蛋白酶剪切纯化的融合蛋，然后再经亲和层析去除蛋白酶和切除的融合标签从而获得天然纯品。然而针对某些特定的融合蛋白，此剪切过程比较困难。另一体系采用内含肽对融合蛋白进行自我剪切从而获得天然N 端的重组蛋白。然而，这一自我剪切过程很缓慢并大大依赖于内含肽与目的蛋白连接处的氨基酸序列（Waugh 2005），因此限制此方法应用于重组蛋白的纯化。
Profinity eXact 纯化介质是Profinity eXact 融合标签系统的一部分，该系统可在E.coli 中高表达重组蛋白并对其进行纯化。它将亲和层析纯化和标签的去除整合成一步，从而解决了亲和层析纯化的重组融合蛋白到获得天然重组蛋白的技术壁垒（Ruan et al, 2004）。将目的蛋白的编码序列克隆至Profinity eXact pPAL7表达载体的Profinity eXact 标签的下游，从而产生了N 端带有标签的重组蛋白（图1）。固定在Profinity eXact纯化介质上的突变的丝氨酸蛋白酶选择性地与Profinity eXact 标签结合（Kd< 100 pM）(Ruan et al, 2004)。通过结合后的清洗过程去除宿主细胞的杂质，然后加入F－或N3－精确地诱发了亲和标签与目的蛋白之间的酶切，从而导致Profinity eXact 标签被固定的蛋白酶滞留在介质上，仅预期的重组蛋白从层析柱上洗脱，且无需其它处理即可将其进行下游应用。
图1 Profinity eXact pPAL 载体
我们利用Profinity eXact 融合标签系统纯化了多种不同分子量的蛋白，并用各种参数测试了它的性能。数据显示了该新型纯化系统的有效性，包括选择性的捕获带标签蛋白、亲和标签柱上的精确剪切，及整体有效并简便的纯化过程。对用Profinity eXact 纯化介质装填的Profinity eXact mini spin 层析柱和Bio-Scale层析柱进行柱性能评价，评价参数有多次纯化和再生循环后介质的稳定性及在变性剂如尿素存在时介质的功效。
方法
在非变性条件下纯化重组蛋白
用于本研究的Profinity eXact 融合标签蛋白都在E.coli 中高表达，并采用Profinity eXact 纯化介质装填的Profinity eXact mini spin 层析柱或Bio-Scale层析柱进行纯化，整个过程遵循Profinity eXact 系统提供的操作手册。
测试多次再生循环Profinity eXact 纯化介质的稳定性
采用1 ml Bio-Scale Mini Profinity eXact 层析柱，在BioLogic DuoFlowTM 层析仪上，对重组的麦芽糖结合蛋白（MBP）进行连续5 次纯化。每次纯化过程中，先用5 CV Profinity eXact 结合/洗涤缓冲液（0.1M 磷酸钠缓冲液，pH7.2）平衡Profinity eXact 层析柱，然后将9 ml 含Profinity eXact 融合标签的MBP E.coli裂解液通过上样环以1 ml/min 的流速上柱，再用10 CV 洗涤缓冲液清洗层析柱以去除宿主细胞杂蛋白。接着用Profinity eXact 洗脱缓冲液（0.1 M 磷酸钠，0.1 M 氟化钠，pH7.2）以0.1 ml/min 流速在室温条件下流经柱床30 分钟，从而引发MBP 的洗脱。最后用6 CV 0.1 M 磷酸以2 ml/min 的流速剥离Profinity eXact介质上的亲和标签从而再生层析柱，再用15 CV Profinity eXact 结合/洗涤缓冲液平衡层析柱。每次纯化过程，目的蛋白的洗脱通过分光光度计检测A280 吸收值进行监控，采用BioFracTM 收集器每2 ml 收集一组分。最后用BioLogic DuoFlow 软件对5 次层析图谱进行比对。每次纯化获得的MBP 量通过合并收集组分的A280 值及MBP 消光系数1.61A280 = 1 mg/ml 计算得到，MBP 的纯度如下所述采用SDS-PAGE 和ExperionTM 自动电泳系统进行测定。
存在尿素的情况下纯化MBP将冻干的作为对照的Profinity eXact 融合标签MBP 的E.coli 裂解物重悬于5 ml 含0，2，或4M 尿素的Profinity eXact 结合/洗涤缓存液中，然后将重悬的裂解液上到用各自重悬液平衡的Profinity eXact 层析柱上，用10 CV 重悬液洗涤去除宿主细胞的杂蛋白后，再用含各自浓度尿素的Profinity eXact 洗脱缓冲液以0.1 ml/min 流速在室温条件下作用30 分钟从而洗脱MBP。MBP 的纯度如下所述采用SDS-PAGE 和ExperionTM 自动电泳系统进行测定。
SDS-PAGE 分析
纯化的重组蛋白与各自样品缓冲液混合，95℃变性5 分钟后上样到SDS-PAGE 胶上，用XT MES 电泳缓冲液在CriterionTM XT 4-12% Bis-Tris gel 上，或用1×Tris-glycine-SDS 电泳缓冲液在CriterionTM 4-20%Tris gel 上进行SDS-PAGE 电泳，电泳参数为200 V, 60 分钟。电泳后，蛋白胶用Bio-SafeTM 考马斯亮蓝G-250在室温下固定染色1 小时，再用水在室温下脱色16－24 小时。脱色胶用Molecular imager® GS-800 成像仪进行显色，然后再用Quantity One® 1-D 分析软件的条带工具进行分析。
Experion Pro260 分析
根据Experion Pro260 分析kit 的操作指南，用Experion 自动电泳系统在还原条件下进行蛋白分离与分析，蛋白纯度和相对量可通过Experion 软件自行计算。
结果和讨论
在非变性条件下纯化无标签重组蛋白
我们利用Profinity eXact 融合标签系统克隆表达并纯化了多种原核和真核蛋白，这些蛋白分子量和寡聚体差异较大，其中一些蛋白的性质已明确，而另一些蛋白的结构特性和生物学功能尚未确定。表1 列出了利用Profinity eXact 无标签系统通用操作指南，无需针对每一蛋白进行优化，即可获得满意纯度的无标签融合蛋白。对于分子量较大的蛋白（>100 kD），如四聚体β半乳糖苷酶，延长结合时间以提高蛋白得率。根据操作指南，添加亚饱和剂量的寡聚蛋白至层析柱中，以确保融合蛋白在柱体加工完全。鉴于用Profinity eXact 系统纯化了多种蛋白，可见重组融合蛋白通过Profinity eXact 标签与介质结合具有高度选择性，且与融合蛋白的序列或结构无关。利用Profinity eXact 结合/洗涤缓冲液可轻易地去除已上样层析柱中的来自表达宿主细胞的杂质，且通常无需增加清洗的力度。通常存在的杂质是目的蛋白的截短片段，这是由于蛋白转录或翻译不完全所导致，并且这一现象在纯化N 端带标签融合蛋白时经常发生。
即使目的蛋白间的一级结构和三级结构差异较大，融合蛋白的柱上剪切也是非常有效和可靠的。某些内切酶商品，如重组肠激酶和factor Ⅹa 存在非特异性剪切，而由于Profinity eXact 标签的非枯草杆菌蛋白酶剪切基序与酶存在广泛的结合，从而排除了酶对目的蛋白的非特异性剪切。事实上我们实验数据也证实了这一特性。纯化的poly-ADP 核糖聚合酶突变体和洋芹糖合酶具有各自独特生物学活性（数据未显示），这表明在温和条件下通过一步纯化并切除标签的过程可保留这些蛋白的生理活性。
用1 ml Bio-Scale Mini Profinity eXact 层析柱在Biologic DuoFlow层析仪上可纯化获得4 mg 无标签GFP突变体，纯度达98％（图2）。此外，如纯化MBP 所示，除了得率不同之外，用Bio-ScaleTM 层析柱和minispin 层析柱纯化GFP，两者性能无明显差别（图3）。这点对从实验规模放大到制备级规模非常重要。
图2. 无标签GFP 突变体的纯化。A, 在Biologic DuoFlow 层析仪上利用Bio-Scale Mini Profinity eXact 层析柱从E.coli 裂解液中纯化GFP 突变体的层析图谱。B, GFP 纯化过程中收集组份的SDS-PAGE 分析。Lane 1, Precision Plus Protein 标准品；Lane 2, E.coli 粗提物；Lane 3,流穿组份中宿主杂质蛋白；Lane 4, 用Profinity eXact 结合/洗涤缓冲液清洗层析柱流出的宿主杂质蛋白；Lane 5, 洗脱的GFP; Lane 6, Precision Plus Protein 标准品。取3μg 纯化的蛋白进行SDS-PAGE，从而测得GFP纯度达98％。
图3. MBP 的纯化。A，在Biologic DuoFlow 层析仪上利用1 ml Bio-Scale Mini Profinity eXact 层析柱纯化MBP，收集的组份进行SDS-PAGE 分析。Lane 1, Precision Plus Protein 标准品；Lane 2, E.coli 粗提物；Lane 3,流穿组份中宿主杂质蛋白；Lane 4,用Profinity eXact 结合/洗涤缓冲液清洗层析柱流出的宿主杂质蛋白；Lane 5, 洗脱的MBP; Lane 6, Precision Plus Protein 标准品。B，利用Profinity eXact Mini spin 层析柱纯化MBP，收集的组份进行SDS-PAGE 分析。Lane 1, Precision Plus Protein标准品；Lane 2, E.coli 粗提物；Lane 3,流穿组份中宿主杂质蛋白；Lane 4, 用Profinity eXact 结合/洗涤缓冲液清洗层析柱，收集的组份1 中的宿主杂质蛋白；Lane 5, 用Profinity eXact 结合/洗涤缓冲液清洗层析柱，收集的组份2 中的宿主杂质蛋白；Lane 6, 洗脱的MBP; Lane 7, Precision Plus Protein 标准品。C，用Experion Pro260 分析kit 在Experion 自动电泳仪上进行洗脱MBP 纯度分析所得电泳图谱。LM，低分子量marker，UM，高分子量marker。
Profinity eXact 纯化介质的稳定性和可再生性
Profinity eXact 纯化介质可再生并多次用于纯化融合蛋白。这已通过在BioLogic DuoFlow 层析仪上用1ml Bio-Scale Mini Profinity eXact 亲和层析柱连续5 次纯化MBP 得以证实。目的蛋白洗脱过程中被固定的蛋白酶所滞留的Profinity eXact 亲和标签，可用0.1 M 磷酸剥离，再生后的层析柱再用Profinity eXact 结合/洗涤缓冲液平衡以进行连续纯化。图4A 对5 次纯化MBP 的层析图进行了叠加，详细的数据分析显示5次连续纯化后，该层析柱保留了90％的结合载量（图4B），为了显现杂质采用相对高上样量以检测每次纯化MBP 的纯度，结果显示每次纯度均>99%（图4C）。
图4. Profinity eXact 纯化介质的稳定性和可再生性。A，在BioLogic DuoFlow 层析仪上用1 ml Profinity eXact 亲和层析柱纯化MBP 多次，并将每次层析图谱进行叠加；B，1 ml Profinity eXact 层析柱多次循环使用后，MBP 结合载量的变化；C，SDS-PAGE 分析每次洗脱的MBP 的纯度。Lane 1, 含Profinity eXact 标签的融合MBP 的E.coli 裂解液；Lane 2, Precision Plus Protein 标准品；Lane 3-7，连续5 次洗脱的MBP 各取3μg 上样；Lane8， Precision Plus Protein 标准品。
| 在存在尿素的条件下纯化重组蛋白 尽管E.coli 是表达外源蛋白常用的宿主细胞，但过表达的重组蛋白在E.coli 聚集仍是获得天然活性分子的主要屏障。在进行层析分离前需用强变性剂，如尿素和盐酸胍溶解聚集的蛋白。为了测试Profinity eXact 是否适用这些层析条件，我们在MBP 裂解液中添加入不同浓度的尿素以评价Profinity eXact 纯化介质的性能。我们发现该介质在存在4 M 尿素的情况下仍保留其结合载量、选择性和剪切活性（图5 和表2）。然而，结合缓冲液含高于4 M 的尿素，则导致洗脱组份中杂质含量升高（目的蛋白纯度下降），目的蛋白得率明显下降（数据未显示）。值得注意的是盐酸胍不适用于纯化ProfinityeXact 融合蛋白。用盐酸胍溶解重组蛋白后，在重组蛋白的捕获过程中，Cl－可引发固定的突变的枯草杆菌酶过早地对融合蛋白进行酶切，从而导致目的蛋白损失。 | 图5. 在BioLogic DuoFlow 层析仪上用1ml Profinity eXact亲和层析柱，在变性和非变性条件下纯化MBP，并进行SDS-PAGE分析。Lane 1,Precision PlusProtein标准品；Lane 2,用Profinity eXact洗脱缓冲液洗脱的3μg MBP；Lane3, 用含2M尿素的Profinity eXact 洗脱缓冲液洗脱的3μg MBP；Lane 4, 用含4M尿素的Profinity eXact洗脱缓冲液洗脱的3μgMBP。 |
结论
我们已利用Profinity eXact 融合标签系统纯化了多种无标签的重组蛋白。该系统是目前仅有的采用通常操作手段仅一步层析过程，即可获得完全去除标签的重组蛋白。通常的亲和标签纯化及去除需要条件优化，并且很费时，而利用Profinity eXact 系统制备无标签、N 端无任何其它残基的重组蛋白只需大约1 小时。该亲和介质较为稳定，可多次用于目的蛋白的纯化，从而节约了成本。同时，我们证实了Profinity eXact纯化介质的结合和柱上剪切特性可在高达4 M 尿素的情况下得以实现。因此，该系统适用于纯化以不溶的聚集体形式存在的重组蛋白。Profinity eXact 融合标签系统的有效性和一致性将使其成为获得高产率无标签重组蛋白的通用平台。
