气相色谱法
一 气相色谱法概述
色谱法概述
色谱法是一种重要的分离分析方法，它是利用不同物质在两相中具有不同的分配系数(或吸附系数、渗透性)，当两相作相对运动时，这些 物质在两相中进行多次反复分配而实现分离。在色谱技术中，流动相为气体的叫气相色谱，流动相为液体的叫液相色谱。固定相可以装在柱内，也可以做成薄层。前者叫柱色谱，后者叫薄层色谱。根据色谱法原理制成的仪器叫色谱仪，目前，主要有气相色谱仪和液相色谱仪。
色谱法的创始人是俄国的植物学家茨维特(Tswett)。1906年，他将从植物色素提取的石油醚提取液倒人一根装有碳酸钙吸附剂的竖直玻璃管中，然后用石油醚淋洗，结果使不同色素得到分离，在管内显示出不同的色带，色谱一词也由此得名。这就是最初的色谱法。后来，这种方法逐渐广泛地用于无色物质的分离，但色谱一词仍沿用至今，在50年代，色谱法有了很大的发展。1952年，詹姆斯和马丁以气体作为流动相分析了脂肪酸同系物并提出了塔板理论。1956年范第姆特总结了前人的经验，提出了反映载气流速和柱效关系的范笨姆特方程，建立了初步的色谱理论。同年，高莱(Golay)发明了毛细管拄，以后又相继发明了各种检测器，使色谱技术更加完善。50年代末期，出现了气相色谱和质谱联用的仪器，克服了气相色谱不适于定性的缺点。近年代，由于检测技术的提高和高压泵的出现，高效液相色谱迅远发展，使得色谱法的应用范围大大扩展。目前，由于高效能的色谱往、高灵敏的检测器及微处理机的使用，使得色谱法已成为一种分析速度快、灵敏度高、应用范围广的分析仪器。
色谱法是一种分离分析技术,经色谱柱分离后,组分要借用其他检测手段一一检测，色谱法的本质在于色谱柱高选择性的高效分离作用和高灵敏度检测技术的结合。混合组份的样品在色谱柱中的分离依据是：同一时刻进入色谱柱的各组份，由于在流动相和固定相之间溶解、吸附、渗透或离子交换的不同，随流动相在色谱柱中运行时，在两相之间进行反复多次（103—106）的分配过程，使得原来分配系数具有微小差别的各组份，产生了保留能力明显差异的效果，进而各组份在色谱柱中的移动速度就不同，经过一定长度的色谱柱后，彼此分离开来，最后按顺序流出色谱柱而进入检测器，在色谱数据处理机或工作站上显示出各组份的色谱行为和谱峰数值。基于上述原理建立的分析方法称为色谱法。气相色谱法是流动相为气体的一类色谱分析法。
二 气相色谱方法开发
方法开发的一般步骤
就GC而言，就是首先确定样品预处理方法，然后优化分离条件。直到达到满意的分离结果。最后建立数据处理的方法，包括定性鉴定和定量测定。当然这一方法要真正成为实用方法，还要进行验证。下面是方法开发的一般步骤。
1) 样品来源及其预处理方法
GC直接分析的样品必须是气体或液体，固体样品在分析前应当溶解在适当的溶剂中，而且要保证样品中不含GC不能分析的组份（如无机盐）或可能会损坏色谱柱的组份。
这样，我们在接到一个未知样品时，就必须了解它的来源，估计可能含有的组分，以及样品的沸点范围。如能确定直接进样分析，只要找一种合适的溶剂，如丙酮，己烷、氯仿，苯等就是GC常用的溶剂。一般讲，溶剂应具有较低沸点，从而使其容易与样品分离。尽可能避免用水，二氯甲烷和甲醇作溶剂，它们对延长色谱柱的使用寿命不利。如果用毛细管分析，应注意样品浓度不要太高，以免造成柱超载，通常样品的浓度为mg/ml级或更低。
如果样品中有不能用GC直接分析的组分，或样品浓度太低，就必须进行必要的预处理，包括采用一些预分离手段，如各种萃取技术，浓缩方法，提纯方法等。
2) 确定仪器配置
所谓仪器配置就是用于分析样品的方法采用什么进样装置，什么载气，什么色谱柱及其什么检测器。比如，要用GC分析啤酒的挥发性成分，就需要一个顶空进样器，要测定水中痕量含氯农药的残留量，就要用电子俘获检测器。就色谱柱而言，常用的固定相有非极性的OV—1（SE—30）弱极性的SE—54，极性OV—17和PEG—20M等，可根据极性相似相容原理来选用，即分离一般脂肪烃类（如柴油或汽油）时多用OV—1（SE—30）。分析醇类和酯类（如含酒精饮料）多用PEG—20M，分析农药残留量则多用OV—17或OV—1701而要分析特殊的样品，如手性异构体，就需要特殊的色谱柱，对于很复杂的混合物，SE—54往往是首先的固定相。
3) 确定安初始操作条件
初始分离条件，主要包括进样量，进样器温度，检测器温度，色谱柱温度和载气流速度。
1. 进样量要根据样品浓度，色谱柱容量和检测器灵敏度来确定。
2. 进样口温度主要有样品的沸点范围决定，还要考虑色谱柱的使用温度。首先要保证待测样品全部汽化，其次要保证汽化的样品组分能够全部流出色谱柱，而不会在柱中冷凝。
原则上进样口温度一般要接近样品中沸点最高的组分的沸点，但要低于易分解组分的分解温度，常用条件为250℃—350℃。
实际操作中，只保证样品完全汽化即可而不必进行很精确的优化。
3. 色谱柱温度的确定主要由样品的复杂程度和汽化温度决定。
原则上既要保证待测物的完全分离，又要保证所有组分能流出色谱柱，且分析时间越短越好。组成简单的样品最好用恒温分析，这样分析周期会短一些。对于组成复杂的样品，常需要用程序开温分离，因为在恒温条件下，如果柱温较低，则低沸点组合分离得好，而高沸点组分的流出时间会太长，造成峰展宽，甚至滞留在柱中造成柱污染，反之柱温太高，低沸点组分又难以分离。
实际上，毛细柱的最大优点就是可以在较宽的温度范围内操作。这样既保证了待测组分的良好分离，又能实现尽可能短的分析时间。
一般地讲，色谱柱的初始温度应接近样品中最轻组分的沸点，而最终温度则则取决于最重组分的沸点。升温速率则要依样品的复杂程度决定，在具体工作中操作条件的选择一定要根据样品的实际分离情况来优化设定。
4. 检测器温度是指检测器加热块温度而不是实际检测点，如火焰的温度。
检测器温度设置原则是保证流出色谱柱的组分不会冷凝，同是又满足检测器灵敏度的要求。大部分检测器的灵敏度受温度影响不大，故检测器温度可参照色谱柱的最高温度设定。
5. 载气流速的确定相对容易一些，开始可按照比最佳流速（氮气约20cm/S、氦气约25cm/S、氢气约为30cm/S）高10%来设定，然后根据分离情况进行调节，原则是既保证待测物的完全分离，又要保证尽可能短的分析时间，用填充柱时载气流速一般设为30ml/min。
当仪器没有配置电子气路（EPC）控制时，必须通过皂膜流量计或测定时间的方法来测定载气流速，通过调节柱前压的方式来改变载气流速，色谱柱越长，内径越小柱温越高，需要柱前压越高。
当所用检测器需要燃烧气和辅助气时，还要设定这些气体的流量。
如FID检测器，可设定为：空气300—400ml/min、氢气30—40ml/min
用毛细柱时：
尾吹气（氮气）可设为30—40ml/min
4) 分离条件优化
分离条件的优化是一个很大的题目，这里只从实用角度简单介绍优化方法。这里只强调操作条件柱温和载汽流速的优化。
事实上，当样品和仪器配置确定后，一个色谱技术人员最经常的工作除了更换色谱柱处就是要改变色谱柱温度和载气流速以期达到最优化的分离。柱温对分离结果的影响要比载气的影响大。
条件优化的目的就是在最短的分析时间内达到符合要求的分离结果。所以在初始条件下样品中难分离物质对的分离度R大于1.5时。可来用增大载气流速，提高柱温或开温速率的措施来缩短分析时间，反之亦然。
比较难的问题是确定色谱图上的峰是否单一组分的峰。可用标准样品对照，如果某一目的峰是两个或以上组分的共流出峰，优化分离的任务就比较艰巨了，在改变柱温和载气流速也达不到基线分离的目的时就应更换更长的色谱柱，甚至更换不同固定相色谱柱，因为在GC中，色谱柱是分离成败的关键。
5) 定性鉴定
所谓定性，就是确定色谱峰的归属，对于简单样品，可根据准物质对照用保留值来确定色谱图上的峰哪个是要分析的峰。
定性时必须注意，在同一色谱柱上，不同化合物可能有相同的保留值，所以对未知物的定性仅仅用一个保留数据是不够的，双柱或多柱保留数值定性是GC中较为可靠的方法，因为不同化合物在不同色谱柱上具有相同保留值的几率要小的多。
6) 定量分析
在这一步骤中是要确定用什么定量方法来测定待测组分的含量。
常用方法有：峰面积（峰高）百分法，归一化法、内标法、外标法和标准加入法（叠加法）。峰面积（峰高）百分比法最简单也最不准确，只做精略定量。
不同化合物在同一条件下，同一检测器上的响应因子往往不同，故须用标准样品测定响应因子进行校正后，方可得到准确的定量结果，故其他几种方法均需校正。归一化法较为复杂，它要求样品中所有组分均出峰且要求所有组分的标准品才能定量，故很少采用。外标法是采用最频繁的方法，只要用一系列浓度的标准样品作出工作曲线（样品量或浓度对峰面积或峰高作图）就可在完全一致的条件下对求知样品进行定量分析，只要待测组分出峰且分离完全即可，而不考虑其他组分是否出峰和分离安全，但是外标法定量，分析条件必须重现，特别是进样量。
相比而言，内标法定量精度最高，因为它是相对于标准物（叫内标物）的响应值来定量的。而内标物要分别加入到标准样品和求知样品中，这样可抵消由于操作条件（包括进样量）的波动带来的误差，与外标法类似，内标法只要求待测组分出峰或完全分离即可，其余组分则可用快速升高柱温使其流出或用反吹法将其放空，这样就可达到缩短分析时间的目的。理想内标物的保留时间和响应因子应该与待测物尽可能接近，且要完全分离，内标定量时，样品制备过程要多一个定量加入内标物的步骤，标准样品和未知样品均要加入一定量的内标物，因此，只要定量精度要求不高，应避免使用内标法。
至于标准加入法，是在未知样品中定量加入待测物的标准品然后根据峰面积（或峰高）的增加量来进行定量计算，其制备过程与内标法类似，但计算原理则完全来自外标法。精确度介于两者之间。
