创伤后应激障碍 ( post-traumatic  stress  disor- der，PTSD) 是种复杂的焦虑障碍。患者在经历了严重的创伤性事件后，表现出回避性行为，恐惧增强及后觉醒状态^［1］。PTSD 的病因复杂，其机制的探索先需要建立个良好的动物模型模拟PTSD 的特征，即: ①具有短期强烈的应激事件;②模拟 PTSD 患者的核心症状，即对创伤性线索的反应性增强，过度觉醒以及社会回避表现; ③症状可持续存在甚至随着时间而增强^［2］。单次延长刺激模型 ( single-prolonged stress，SPS) 能够较好模拟 PTSD 发病过程及患者出现的部分核心症状，如逐渐产生的焦虑行为和过度觉醒，因此日渐受到研究者的关注，并广泛用于 PTSD 的神经生物学机制研究^［3］。SPS 造模^［4］是个连续的过程，这种连续性应激可使动物对条件恐惧僵住反应增强，同时损坏其恐惧记忆的消退功能，*终导致动物对创伤无关的刺激做出过度的生理和行为反应^［4］。γ-氨基丁酸 ( γ-aminobutyric acid，GABA) 是**神经系统重要的抑制性神经递质，可以调节机体面对应激时的生理反应^［5］。GABA 受体包括离子型的 GABA_A 和 G-蛋白偶联的 GABA_B 受体两种亚型，均在焦虑调节中发挥重要作用^［6］。分子遗传学研究发现 GABA 系统和 PTSD 的发生具有关联性，例如，GABA β3 亚基 3 ＇端的微卫星序列的多态性和 PTSD 的发生率存在相关性^［7］。另有研究发现 PTSD 患者的脑内 GABA 水平降低^［8］。因此GABA 系统的功能异常可能参与 PTSD 的发生。海马是负责空间学习记忆的重要脑区，主要功能是将短期记忆固化为长时间记忆以及空间记忆的形成。同时，大量研究表明海马也参与应激及情绪的调节^［3］。影像学研究发现 PTSD 患者的海马，同遭受应激但是没有 PTSD 症状的人相比显著缩小^［9］，提示海马的功能异常可能参与 PTSD 的发生。CA1 和CA3 是海马的重要亚区，CA3-CA1 突触传递在学习记忆和应激反应中发挥重要作用。但研究发现CA3 和 CA1 对应激的反应，如应激导致的长时程增强 ( long-term  potentiation，LTP) 及些基因的表达调节是不同的，这取决于应激的种类和应激时间^［10-11］。因此在本研究中我们将应用 SPS  作为 PTSD 的动物模型，验证 SPS 所导致的增强的焦虑性行为并观察其对海马 CA1 和 CA3 亚区 GABA_A 和 GABA_B 受体的蛋白表达量的影响。

1 对象与方法

1. 1 实验动物

雄性 Sprague-Daw ley  ( SD ) 大鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号: S ( 京) 2001 － 2003，体重平均在 200 ～ 220g。采用12 小时昼夜节律控制 (8: 00 － 20: 00 )。实验室湿度和温度均符合实验标准。实验开始，动物在动物房适应性饲养 7 d，自由饮水，进食。实验大鼠随机分为未造模组、SPS 造模 1 d 和SPS 造模 14 d 组，每组各 8 只。经过造模后，SPS 造模 1 d 和SPS 造模14 d 所剩动物分别为7 只和6 只。应用旷场和高架十字实验测试 3 组大鼠的焦虑程度; 行为学测试 24 h 后，断头取脑检测 CA3 和 CA1 脑区GABA_A 和 GABA_B 的表达情况。

1. 2 实验材料和试剂

小动物强迫游泳视频分析系统，; 电泳仪、电泳槽，; 大鼠束缚容器，;  高架十字迷宫，。抗兔GABA_A 抗体 ( Abcam，美国)，抗兔GABA_B 抗体 ，抗小鼠 β-Actin 抗体，辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠 IgG抗体，辣根过氧化物酶标记羊抗兔 IgG 抗体 。

1. 3 PTSD 模型的建立

成年SD 大鼠，在动物房适应性饲养7 d 左右.先使用硬质塑料盒 ( 使大鼠四肢及躯干束缚在瓶中，尾巴露在外面) 给予大鼠 2 h 的束缚，紧接着让其在 20 ～ 24 ℃ 水温进行 20 min 的强迫游泳， 之后休息15 min，*后用麻醉直至无抵抗。束缚期间温度和湿度都与正常饲养环境致，待应激结束后分笼放回动物房饲养。

 

 

    不同处理组间 CA3 脑区 GABA_A 受体和 GAB- A_B 受体表达差异有统计学意义，Post-hoc 分析发现，同未造模动物相比，造模 14 d 组大鼠 CA3 脑

3 讨 论

创伤后应激障碍的临床症状表现多样，主要是 患者在经历精神创伤性事件后数天至数月内发生的 创伤性经历再体验、情感麻木、回避行为和过度觉 醒导致的易激惹状态^［1］。建立效度好的动物模型 是研究 PTSD 发病机制的关键手段之，但目仍无个被广泛接受的动物模型。之的研究已经构 建了些动物模型如电击模型，捕食者场景模型以 及边缘系统点燃模型等^［2］。虽然这些模型在定 程度上模拟创伤性应激，但是对于些 PTSD 的关键特征，如由创伤性应激导致的时间依赖性增强的 敏感化表现并不能很好的模拟^［4］。有研究表明，

Liberzon 等建立的 SPS 动物模型可较好地模拟PTSD 患者出现的恐惧记忆、焦虑反应增强、警觉性明显增高及相关神经***改变^［4］。同时，经历了 SPS 的动物还表现出恐惧记忆消退受损，进而导致动物对与创伤无关的刺激做出过度的生理和行为反应。因此，SPS 动物模型已经成为目常用的PTSD 动物模型之^［3］。本研究采用SPS 动物模型，发现动物经历 SPS 造模后第 1 天的焦虑样行为无显著性变化，而在第 14 天的焦虑样行为显著升高，验证了 Serova 等多个课题组关于 SPS 可以导致延迟性发生的焦虑反应增强和警觉度增高的现 象^［14］，表明 SPS 模型具有好的效度和重复性。

有研究指出，海马在调控应激和焦虑样行为中发挥着重要作用^［15］。长时间束缚应激导致大鼠海马CA3 亚区神经元树突萎缩，动物在高架十字迷宫开放臂中的探索减少^［16］。机体在遭受应激时 CA3- CA1 的 LTP 受损同时伴随有 BDNF 的降低^{［10，17］}。临床研究发现，创伤后应激障碍患者对环境性线索 的识别受损，提示海马功能受损可能在 PTSD 发病中发挥着重要作用。GABA 是神经系统中重要的抑制性递质，可以防止神经系统的过度激活及谷氨 酸的过度释放^［18］。动物实验发现慢性应激可导致 海马 CA1 和 CA3 区 GABA 能神经元数量降低^［19］， 慢性暴露于应激水平的肾上腺皮质**导致海马GABA_A 受体亚基表达异常，但是不同亚基表达变化在 CA1 和 CA3 区呈现不同的模式^［11］。临床发现，GABA  β3 3＇端的微卫星序列的多态性和 PTSD的发生率存在相关性^［7］。本研究发现 SPS 造模 14 d 后海马 CA1 和 CA3 亚区中的 GABA_A 和 GABA_B 蛋白表达均显著性降低，这和其焦虑样行为出现的 时间点相符，这和人关于机体遭受应激 CA3- CA1 的 GABA 递质传递调控异常的研究相致， 并提示海马的 GABA 受体异常表达可能调控 PTSD 部分症状发生，如增强的焦虑及警觉度。本研究的不足之处是未对 SPS 导致的其他PTSD 样行为特征如恐惧记忆的形成和消退的影响， 及PTSD 样行为和 GABA 受体的表达降低进行因果关系探索。因此，后的研究中我们将对 CA1  和CA3 脑区 GABA 受体进行调节， 以便观察海马CA1 和 CA3 脑区 GABA 受体的异常表达是否调控了大鼠 PTSD 样行为的产生。

原创作者：安徽耀坤生物科技有限公司